小分子篩選下游靶點(diǎn)蛋白是藥物發(fā)現(xiàn)、疾病機(jī)制研究以及生物學(xué)功能探究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。小分子藥物結(jié)合靶點(diǎn)蛋白的發(fā)現(xiàn)，不僅能幫助理解疾病的分子機(jī)制，也能指導(dǎo)藥物的設(shè)計(jì)與優(yōu)化，從而提高藥效、減少副作用，并推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。達(dá)吉特針對(duì)此提供了兩類不同的靶點(diǎn)篩選方案，方案一：基于修飾的策略，引入標(biāo)記基團(tuán)，提高篩選效率，便于后續(xù)分析，適用于可以進(jìn)行生物素或炔基標(biāo)記的小分子；方案二：非修飾策略，適用于不能夠進(jìn)行化學(xué)修飾的小分子，保持小分子原貌，技術(shù)難度較低，直接反應(yīng)小分子與靶點(diǎn)的相互作用。從小分子標(biāo)記到小分子靶點(diǎn)篩選再到小分子靶點(diǎn)蛋白的驗(yàn)證，達(dá)吉特具備全鏈條服務(wù)體系，幫助研究人員在多個(gè)階段有效篩選和驗(yàn)證潛在的藥物靶點(diǎn)。(達(dá)吉特官網(wǎng)：www.tgtmed.com)

丨 方案一：基于修飾的策略

No.1 20K人類蛋白組芯片

芯片上有超過2萬種人類全長蛋白質(zhì)，覆蓋81%的人類基因組ORF區(qū)，是目前世界上通量最高的蛋白質(zhì)芯片。將帶有生物素標(biāo)記的小分子與20K芯片共同孵育，再引入帶有CY3或CY5熒光的鏈霉親和素，通過檢測(cè)芯片上的熒光信號(hào)，即可確定小分子的直接結(jié)合靶蛋白。20K芯片不僅能夠篩選出與小分子直接結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白，還能解決傳統(tǒng)方法中由于蛋白豐度低而難以捕捉的藥-靶結(jié)合問題，更因其具備豐富的蛋白種類，單次實(shí)驗(yàn)即可產(chǎn)出多項(xiàng)科研成果，具有極高性價(jià)比。

丨 技術(shù)路線

Step1：將小分子標(biāo)記上生物素

Step2：標(biāo)記了生物素的小分子和芯片共同孵育

Step3：加入帶有熒光的鏈酶親和素

Step4：固定波長下進(jìn)行熒光檢測(cè)，讀取芯片上的熒光信號(hào)值

丨 芯片優(yōu)勢(shì)

1.  篩選直接結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白，假陽性率較低

2. 無需克隆構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

3. 芯片覆蓋多種蛋白類型，結(jié)合蛋白范圍更廣，性價(jià)比較高

4. 采用酵母表達(dá)純化，蛋白豐度高，可檢測(cè)到微弱蛋白互作現(xiàn)象

No.2  ABPP基于炔基標(biāo)記的點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)

ABPP（Activity-Based Protein Profiling）是在點(diǎn)擊化學(xué)和LC-MS質(zhì)譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來的小分子化合物靶點(diǎn)蛋白的篩選技術(shù)。將小分子進(jìn)行炔基標(biāo)記后處理細(xì)胞，通過簡便高效的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將結(jié)合上靶點(diǎn)蛋白的炔基小分子連接到帶有疊氮的磁珠上，通過磁珠離心獲取小分子靶向結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白。進(jìn)一步，通過LC-MS分析出小分子的潛在靶點(diǎn)蛋白。

丨 技術(shù)路線

Step1：小分子進(jìn)行炔基標(biāo)記

Step2：標(biāo)記了炔基的小分子與細(xì)胞共孵育

Step3：預(yù)實(shí)驗(yàn)，使用熒光標(biāo)記的疊氮與細(xì)胞裂解液共同孵育，通過熒光凝膠以及熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)反應(yīng)條帶

Step4：正式實(shí)驗(yàn)，使用生物素標(biāo)記的疊氮與細(xì)胞裂解液共同孵育

Step5：利用鏈霉親和素磁珠釣出靶蛋白

Step6：質(zhì)譜分析，鑒定靶蛋白

丨 特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)

1.  炔基修飾對(duì)小分子的活性和結(jié)構(gòu)影響小，幾乎不干擾小分子原本的生物活性

2.  炔基標(biāo)記的小分子可在活細(xì)胞水平上進(jìn)行靶點(diǎn)篩選

3.  研究方向明確，篩選到的是與研究方向相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白

4.  擁有完整的小分子炔基標(biāo)記體系

No.3  Pull down+MS技術(shù)

小分子藥靶篩選的Pull down實(shí)驗(yàn)是一種有效的篩選藥物與潛在靶蛋白之間相互作用的體外技術(shù)。利用生物分子之間的親和力原理，將生物素標(biāo)記的小分子化合物固定在鏈霉親和素的磁珠上，與蛋白裂解液進(jìn)行孵育，孵育結(jié)束后與小分子結(jié)合的蛋白可以通過質(zhì)譜檢測(cè)，將下游的靶點(diǎn)蛋白鑒定出來。該方法簡單易行，操作方便，在藥靶篩選方面已得到廣泛的應(yīng)用。

丨 技術(shù)路線

Step1：小分子進(jìn)行生物素標(biāo)記

Step2：標(biāo)記了生物素的小分子與鏈霉親和素磁珠共同孵育，將小分子固定到磁珠上，形成小分子探針

Step3：將小分子探針與細(xì)胞裂解液共同孵育

Step3：離心、洗脫，獲取靶蛋白

Step4：質(zhì)譜分析，對(duì)靶蛋白進(jìn)行鑒定

丨 特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)

1.  不受結(jié)合原理限制，適用范圍廣

2.  研究方向明確，篩選到的是與研究方向相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白

3.  鑒定到的靶點(diǎn)蛋白數(shù)量較多

4.  可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)與小分子結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白及其互作網(wǎng)絡(luò)譜

No.4  SPIDER基于鄰近標(biāo)記技術(shù)的膜蛋白靶點(diǎn)篩選技術(shù)

SPIDER技術(shù)的原理基于結(jié)核分枝桿菌類泛素蛋白酶體系統(tǒng)中底物Pup分子在體外能夠招募PafA連接酶發(fā)揮鄰近標(biāo)記作用。將小分子進(jìn)行生物素標(biāo)記后處理活細(xì)胞，當(dāng)小分子與靶蛋白（Target）發(fā)生相互作用時(shí)，會(huì)同時(shí)與偶聯(lián)了生物素的SAm-PupE靠近。在PafA酶的催化作用下，PupE的C末端會(huì)與Target蛋白表面的賴氨酸殘基共價(jià)相連，形成類泛素連接反應(yīng)，進(jìn)一步，通過LC-MS分析出小分子的潛在靶點(diǎn)蛋白。該過程將小分子與蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)結(jié)合相互作用轉(zhuǎn)換為SAm-PupE與靶蛋白的共價(jià)連接，從而能夠穩(wěn)定地用于后續(xù)靶蛋白的富集、鑒定和分析。

丨 技術(shù)路線

Step1：小分子進(jìn)行生物素標(biāo)記

Step2：標(biāo)記了生物素的小分子與活細(xì)胞共同反應(yīng)

Step3：引入帶有PupE的鏈酶親和素和PafA酶

Step3：利用生物素磁珠釣取靶蛋白

Step4：質(zhì)譜分析，對(duì)靶蛋白進(jìn)行鑒定

丨 特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)

1. 在活細(xì)胞水平上進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，能夠保證膜蛋白的活性；

2. 將小分子與互作蛋白轉(zhuǎn)為共價(jià)結(jié)合，形成類泛素化連接反應(yīng)；

3. 嚴(yán)苛洗脫條件降低非特異性干擾。

丨 方案二：非修飾的策略

No1. DARTS藥物親和反應(yīng)靶向穩(wěn)定性技術(shù)

藥物親和反應(yīng)靶向穩(wěn)定性技術(shù)（Drug Affinity Responsive Target Stability，DARTS）是由美國University of California科研團(tuán)隊(duì)于2009年提出的。該方法操作簡便，可適用于大多數(shù)小分子化合物。DARTS技術(shù)是基于蛋白的酶解穩(wěn)定原理，即小分子和靶點(diǎn)蛋白結(jié)合后增強(qiáng)靶點(diǎn)蛋白的酶解穩(wěn)定性。在正常情況下，靶點(diǎn)蛋白容易被廣譜的蛋白酶水解成多個(gè)肽段。然而，當(dāng)小分子化合物與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合后，這種結(jié)合作用會(huì)穩(wěn)定靶點(diǎn)蛋白的結(jié)構(gòu)，使其更難被蛋白酶水解。比對(duì)加藥組與未加藥組蛋白酶處理后的蛋白殘留情況，最后通過質(zhì)譜鑒定到小分子的潛在靶點(diǎn)蛋白。

丨 技術(shù)路線

Step1：預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索最適酶濃度

Step2：正式實(shí)驗(yàn)，小分子與靶細(xì)胞裂解液共孵育，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取最適酶濃度處理，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳

Step3：利用質(zhì)譜鑒定靶點(diǎn)蛋白

丨 特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)

1. 小分子無需修飾，其構(gòu)象與活性不產(chǎn)生影響

2. 實(shí)驗(yàn)原理簡單，服務(wù)周期短

3. 每組3重復(fù)，排除個(gè)體差異

4. 不適于在自然條件下抵抗蛋白質(zhì)水解的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域

No2. LiP-MS限制性酶解-質(zhì)譜分析技術(shù)

限制性酶解-質(zhì)譜分析技術(shù)LiP-MS（Limited proteolysis-coupled mass spectrometry）是一種基于有限蛋白酶切的化合物靶點(diǎn)篩選技術(shù)，其獨(dú)特之處在于無需對(duì)化合物進(jìn)行修飾即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定化合物結(jié)合肽段進(jìn)行篩選。小分子與蛋白質(zhì)相互作用后，利用兩種蛋白酶交叉切割，最后利用質(zhì)譜技術(shù)分析酶解的多肽產(chǎn)物，通過數(shù)據(jù)分析比對(duì)兩種酶作用后產(chǎn)生的多肽及位點(diǎn)的不同，鑒定出能夠與小分子結(jié)合的特定肽段，從而確定小分子結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白。

丨 技術(shù)路線

Step1：小分子與靶細(xì)胞裂解液共孵育

Step2：PK酶處理后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳

Step3：酶解樣品，利用質(zhì)譜鑒定靶點(diǎn)蛋白

丨 特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)

1. 無需對(duì)小分子進(jìn)行修飾，避免了因修飾可能導(dǎo)致的小分子活性改變，服務(wù)周期短

2. 能夠篩選到小分子與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合的肽段，可進(jìn)行個(gè)性化數(shù)據(jù)分析

3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)置每組3重復(fù)，排除個(gè)體差異

4. 更適用于代謝產(chǎn)物及小分子量化合物的靶點(diǎn)篩選研究

No.3 CETSA細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移技術(shù)

細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移技術(shù)（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）是2013年由瑞典Karolinska研究所團(tuán)隊(duì)研發(fā)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。該技術(shù)基于蛋白的熱穩(wěn)定性原理，即小分子與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合后會(huì)增強(qiáng)靶點(diǎn)蛋白的熱穩(wěn)定性。隨著溫度的升高，部分蛋白會(huì)逐漸降解。相同溫度下，結(jié)合了藥物的蛋白質(zhì)具有更高的熱穩(wěn)定性，相比未結(jié)合藥物的蛋白質(zhì)，未降解蛋白的量會(huì)提高，同時(shí)該復(fù)合蛋白的熱熔曲線發(fā)生改變，進(jìn)一步通過質(zhì)譜鑒定到小分子的潛在靶點(diǎn)蛋白。

丨 技術(shù)路線

Step1：小分子與靶細(xì)胞共孵育

Step2：進(jìn)行梯度升溫處理后離心，從沉淀蛋白中分離出可溶性蛋白

Step3：收集上清液，利用質(zhì)譜鑒定靶點(diǎn)蛋白

丨 特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)

1.  小分子無需修飾，其構(gòu)象與活性不產(chǎn)生影響

2.  實(shí)驗(yàn)原理簡單，服務(wù)周期短

3.  需要提供靶細(xì)胞，研究方向明確

4.  不適用于在自然條件下耐溫的蛋白質(zhì)

丨關(guān)于達(dá)吉特

上海達(dá)吉特藥業(yè)科技有限公司(簡稱：達(dá)吉特)，坐落于上海市閔行區(qū)臨港浦江國際生命健康城，是一家專業(yè)開展小分子與藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)的研發(fā)與服務(wù)的專業(yè)性高科技企業(yè)。

達(dá)吉特核心團(tuán)隊(duì)成員由上海中醫(yī)藥大學(xué)、上海交通大學(xué)和華東理工大學(xué)等知名醫(yī)藥院校的藥物化學(xué)、藥理學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)等跨學(xué)科專家組成，致力于為臨床前階段的藥物研發(fā)提供創(chuàng)新性的技術(shù)產(chǎn)品和CRO服務(wù)。達(dá)吉特的主要業(yè)務(wù)包含“從藥到靶”和“從靶到藥”兩個(gè)方面，涵蓋中藥/復(fù)方活性成分發(fā)現(xiàn)、天然化合物庫構(gòu)建、苗頭藥物篩選、小分子修飾與改造、小分子直接靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證等多種業(yè)務(wù)類型。達(dá)吉特正在為創(chuàng)新小分子藥物研發(fā)和中國的中藥現(xiàn)代化提供越來多的助力。

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